丙戊酸钠联合替莫唑胺对人胶质瘤U251、SHG44细胞的作用及可能机制研究

【摘要】目的：本文旨在观察甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT）抑制剂丙戊酸钠(VPA)联合抗肿瘤药物替莫唑胺(TMZ)对神经胶质瘤细胞U251、SHG44的体外抗瘤效应；探讨其可能的相关机制。为以TMZ为基础的胶质瘤联合化疗提供实验依据。方法：1、丙戊酸钠、替莫唑胺单独对U251、SHG44细胞体外作用的研究（1）给药方案：两种胶质瘤细胞分别给以不同浓度的替莫唑胺或丙戊酸钠，并以空白组做为对照。（2）体外培养神经胶质细胞瘤U251、SHG44细胞，培养至80%细胞密度时，按照上述分组给予药物干预，作用48小时，采用MTT比色法检测各组细胞增殖情况变化。选取两种药物的最适浓度进行后续试验。2、丙戊酸钠联合替莫唑胺对U251、SHG44细胞体外作用的研究（1）实验分组：1.空白对照组；2.替莫唑胺单独用药组；3.丙戊酸钠单独用药组；4.丙戊酸钠和替莫唑胺联合用药组。（2）体外培养U251、SHG44细胞，按照上述分组给药，作用48小时后，进行以下实验：1.倒置相差显微镜观察细胞形态学变化；2.MTT比色法检测细胞增殖变化；3.流式检测细胞凋亡变化；4.DAPI染色法荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变化。（3）PI染色后流式细胞仪上检测各组细胞周期变化。3、丙戊酸钠联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤作用的可能机制研究体外培养神经胶质细胞瘤U251细胞，应用WesternBlotting法检测各组细胞中E-cadherin、c-Myc及cyclin-D1、capase-3、capase-8、p-53、Bax和Bcl-2的表达。结果：1、丙戊酸钠、替莫唑胺单独对U251、SHG44细胞体外作用的影响MTT比色法检测丙戊酸钠、替莫唑胺分别作用后U251、SHG44细胞增殖情况：结果显示，TMZ及VPA对两种胶质瘤细胞生长均有抑制作用，并随着药物浓度的增加，增值速度逐渐下降，呈剂量依赖性。在后续试验中，即VPA与TMZ联合用药时，我们主要是为了利用VPA作用于细胞，抑制MGMT活性，提高胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，故我们选择TMZ的半数抑制浓度即1mmol/l，而VPA选择1mmol/l、2mmol/l的低抑制浓度进行以后的一系列试验。2、丙戊酸钠联合替莫唑胺对U251、SHG44细胞体外作用的影响(1)药物干预后，应用倒置相差显微镜观察SHG44细胞形态学变化：1.空白对照组的细胞数目较多，细胞透亮，呈梭形且贴壁生长，折光性好。2.相比对照组，单用替莫唑胺组细胞数量减少，细胞体积缩小、变圆，透亮度及折光性减弱，胞间连接减少；单用丙戊酸钠的两组细胞状态与对照组相比无明显差别。联合用药组较对照组细胞体积缩小、折光性减弱更加明显，并有漂浮细胞出现，培养基浑浊。并随丙戊酸钠浓度增加，细胞形态变化越明显。(2)MTT比色法检测联合用药对U251、SHG44细胞增殖的影响：结果显示，SHG44细胞替莫唑胺组OD值为：0.86±0.02，丙戊酸钠组OD值分别为0.72±0.03、0.62±0.03，联合用药组OD值分别为0.63±0.03、0.49±0.03；U251细胞替莫唑胺组OD值为0.86±0.07，丙戊酸钠组OD值分别为0.86±0.09、0.66±0.07，联合用药组OD值分别为0.73±0.05、0.50±0.12。与空白对照组相比较，其他各药物干预组OD值均明显降低(p<0.01)，表明细胞增殖速度下降；实验结果还表明，相比丙戊酸钠、替莫唑胺单独用药，联合用药使两种细胞的增殖速度更为显著的下降(p<0.01)。（3）流式检测药物干预后U251、SHG44细胞凋亡率变化：流式细胞仪检测两组细胞对照组、丙戊酸钠组、替莫唑胺组、联合用药组细胞凋亡率分别为：SHG44细胞：3.3%，4.1%，7.5%，29.4%，53.7%，72.5%；U251细胞：2.7%，3.2%，3.4%，12.0%，29.8%，33.2%。与对照组相比，两种细胞中丙戊酸钠组细胞凋亡不明显，替莫唑胺组细胞的凋亡率显著增加（p<0.01)，而联合用药组细胞的凋亡率比明显高于丙戊酸钠组和替莫唑胺组(p<0.01)。（4）药物干预后各组细胞经DNA荧光染料DAPI染色，应用荧光显微镜观察细胞核形态变化。DAPI染色的正常细胞核无固缩，呈体积较大的浅染核形态，核内DNA分布相对均匀；若细胞凋亡，凋亡细胞核出现不同程度的固缩，呈致密浓染的深染核形态，核内DNA浓聚，有细胞凋亡的典型特征。本实验染色结果表明，空白对照组和丙戊酸钠组均少有细胞凋亡；替莫唑胺组细胞凋亡数量增多；联合用药组细胞凋亡更加显著。（5）采用PI染色后流式细胞仪上检测SHG44各组细胞周期变化。结果显示，相比对照组（S期19.40%），替莫唑胺组使细胞S期占42.57%（p<0.05），联合用药组S期比值增至74.30%（p<0.05）；且相对而言，G1期细胞比例由对照组的75.61%降低至替莫唑胺作用后的48.37%（p<0.05），而联合用药后这一比例更为显著的降低至25.70%（p<0.05）。以上结果说明TMZ作用于胶质瘤细胞后，可使细胞停滞于G1-S期，并且丙戊酸钠能显著增强替莫唑胺对细胞周期的抑制作用。3、丙戊酸钠联合替莫唑胺对神经胶质细胞瘤细胞作用的可能机制研究WesternBlotting法检测药物作用后U251细胞中E-cadherin、c-Myc及cyclin-D1、capase-3、capase-8、p-53、Bax和Bcl-2的表达情况：与对照组比较，丙戊酸钠组E-cadherin、c-Myc、cyclin-D1、capase-3、capase-8、p53及Bcl-2、Bax表达无明显差别，替莫唑胺组和联合用药组E-cadherin、c-Myc、cyclin-D1、capase-3、capase-8及Bax表达上调，p53、Bcl-2的表达水平下调，联合用药组上述蛋白相应的表达水平变化较替莫唑胺组更为明显。结论：1、替莫唑胺及丙戊酸钠均能抑制神经胶质瘤细胞瘤U251、SHG44生长，并呈剂量依赖性；2、丙戊酸钠增强了替莫唑胺对U251、SHG44细胞凋亡形态学变化，更为明显抑制细胞增殖，细胞周期停滞，促进细胞凋亡；3、丙戊酸钠联合替莫唑胺促进神经胶质细胞瘤U251、SHG44细胞凋亡可能是通过调节多种凋亡相关蛋白的表达水平来实现的。4、丙戊酸钠增强了神经胶质细胞瘤U251、SHG44细胞对替莫唑胺的化疗敏感性。
【作者】武云龙；
【导师】付玉；郭永川；
【作者基本信息】吉林大学，神经外科学，2014，硕士
【关键词】神经胶质细胞瘤；替莫唑胺；丙戊酸钠；联合；

【参考文献】
[1]米旭光.抑制TSP50表达的中药化合物筛选及其抗肿瘤作用及机制研究[D].东北师范大学,细胞生物学,2014,博士.
[2]王危危.《黄帝内经》形神一体观研究[D].黑龙江中医药大学,中医基础理论,2013,硕士.
[3]范勃.成器之道：艺术创作中的模仿、融合与创造[D].中央美术学院,美术学,2014,博士.
[4]贾东琴.高校图书馆组织机构变革历程分析[J].图书情报知识,2015,02:28-36.
[5]何江.政府办公自动化系统的分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[6]陈留群,孙光辉,李春林,金江彬.从碳纳米管到石墨烯——浅谈碳纳米材料的研究进展[J].材料导报,2011,S2:115-117+124.
[7]叶雪莲.初三学生英语分层次作业设计研究[D].杭州师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[8]潘培玉,张梅青.市场潜力、产业集聚与北京交通拥堵探析[J].北京交通大学学报(社会科学版),2014,03:10-16.
[9]高叔开,纪连恩,高磊.火电机组分布式控制系统仿真新思路[J].电力系统自动化,2005,10:73-75.
[10]冯清爽.阀控摆动马达被动式电液力伺服系统的控制研究[D].河南科技大学,机械电子工程,2014,硕士.
[11]吴茂敏.交通肇事罪若干问题研究[D].中国海洋大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[12]谢国辉,张粒子,葛炬.节能发电调度旋转备用计划优化[J].电力系统自动化,2009,13:43-46+72.
[13]范艳煌,邹正光,龙飞,吴一,高洁,孔令奇.以氧化石墨烯为氧化介质制备石墨烯/聚苯胺导电复合材料[J].复合材料学报,2013,01:27-31.
[14]苏阳平.H.264高清视频解码器中存储结构的设计与验证[D].哈尔滨工业大学,微电子学与固体电子学,2014,硕士.
[15]杨红亮,史丹,肖洁.自然环境因素对能源效率的影响——中国各地区的理论节能潜力和实际节能潜力分析[J].中国工业经济,2009,04:73-84.
[16]李剑虹.四花穴麦粒灸配合针刺治疗阴虚火旺型失眠临床研究[D].广州中医药大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[17]罗秋香.信丰县生态公益林经营类型划分的研究[D].江西农业大学,森林经理学,2012,硕士.
[18]金雯.浙江某高校大学生抑郁焦虑流行现况及相关因素的横断面研究[D].浙江大学,流行病与卫生统计学,2014,硕士.
[19]曹建农,李德仁,关泽群.基于可分解马尔科夫网的视频图像检测方法研究[J].光学学报,2005,03:312-318.
[20]陈娟.论社会环境与青少年健康发展[D].安徽大学,思想政治教育,2014,硕士.
[21]何文玲.南岳秋韵—创作报告[D].湖南师范大学,美术（专业学位）,2014,硕士.
[22]杨旦阳.香鱼CCL4-like基因的克隆、序列分析及免疫相关性表达变化分析[D].宁波大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[23]焦银春.聚丙烯酰多乙烯多胺系树脂的合成及对LDL的吸附性能研究[D].湖南师范大学,有机化学,2004,硕士.
[24]彭帅.基于DSP的电动叉车交流驱动控制器的设计与实现[D].南京理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[25]杨勇.通信基站建设中的物权保护[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[26]姜宽.两种不同来源的卵转铁蛋白N-糖链的质谱分析与比较[D].西北大学,细胞生物学,2014,硕士.
[27]董少敏.当代大学生责任教育析论[D].宁波大学,思想政治教育,2013,硕士.
[28]王娟娟.基于SSL和ECC的P2P安全通信模型的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2012,硕士.
[29]顾汀汀.指定居所监视居住制度研究[D].上海交通大学,法律,2013,硕士.
[30]沈淑红.基于MTS理论的多团队系统协作过程与效能的作用机制研究[D].浙江工商大学,企业管理,2014,硕士.
[31]高峰.河北省青少年女子业余足球队体能训练研究[D].河北师范大学,体育教学,2012,硕士.
[32]张晶.影响苜蓿游离小孢子的培养因素的研究[D].新疆农业大学,草业（专业学位）,2012,硕士.
[33]郑谞,张有兵,周文委,杨光豪,冯亮,王新成.中频(400Hz)谐波监测及无功补偿综合装置的研究[J].机电工程,2013,06:732-736.
[34]杨洁.问答型社交网站使用行为与在线社会资本获取的关系研究[D].厦门大学,新闻与传播,2014,硕士.
[35]徐晓航,曹丽霞.虚拟仪器技术在特种设备安全检测领域中的应用研究[J].中国安全科学学报.2004(01)
[36]匡俊伟.我国区域立法及指标评估[D].广西师范大学,宪法学与行政法学,2013,硕士.
[37]袁柳,李战怀,陈世亮.基于本体的DeepWeb数据标注[J].软件学报,2008,02:237-245.
[38]李厚霖.基于平衡计分卡的绩效管理应用研究[D].山东财经大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[39]项松林.马克思的交往理论与时代发展[D].安徽大学,马克思主义哲学,2004,硕士.
[40]梁嘉骅,范建平,葛振忠.Internet环境下企业环境信息误导与识别[J].石油工业计算机应用,2001,02:5-10.
[41]王鑫.大学生心理健康教育知识共享平台构建研究[D].东北大学,管理科学与工程,2009,硕士.
[42]刘伟.2B_0轴式33吨大轴重机车轴箱定位方式的研究[D].西南交通大学,交通运输工程,2013,硕士.
[43]蔡涛.葡萄1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）基因的表达特性及在番茄中过量表达的研究[D].南京农业大学,果树学,2013,硕士.
[44]李瑜.桩与土相互作用体系的有限元研究初探[D].河海大学,水工结构工程,2004,硕士.
[45]雷志雄.活血通络法治疗慢性乙型肝炎肝纤维化瘀血阻络证的临床观察[D].湖北中医药大学,中医内科学（专业学位）,2013,硕士.
[46]刘军.三维图形系统的动态窗口特效算法设计与实现[D].华中科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[47]陈斌,张进,王家德.新型高效净水器处理生活污水研究[J].水处理技术,2015,03:86-88.
[48]张朝阳.论体育大学生素质教育与思想政治工作的互动[D].西北工业大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[49]郝丽萍.绵萆薢提取物调血脂作用及其薯蓣皂苷元的含量测定方法研究[D].青岛大学,药理学,2013,硕士.
[50]刘芳.健身气功·易筋经改善类风湿关节炎患者患肢功能的研究[D].北京体育大学,民族传统体育,2013,硕士.